2013-05-21_095517  

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同文章請移至新網址 -> [NGS]淺談Exome sequencing--SureSelect實驗原理

在介紹過NGS的基本原理與概念之後,接下來我們將繼續為各位介紹NGS技術的各種應用。

 

2009Choi M等人在Nature期刊上發表的一篇文獻中提到,在人類的基因體中,會表達蛋白質的區域大約只佔全基因體長度的1%左右,但在這些exon區域產生的mutation當中,卻有85%以上會導致人類產生明顯的疾病。

 

而在NGS技術發展日益成熟的現在,利用定序的方法來大量篩檢與疾病有關基因的做法已經成為可能,但如果科學家們只是想觀察全基因體當中屬於exome那一小部分的序列變化,似乎就沒有必要再進行全基因體的定序工作,只需要將他們感興趣的exome部分純化分離出來進行定序分析,就可以達到這個目的。

 

為了滿足這樣的實驗需求,安捷倫公司推出了兩樣關於exome capture產品─SureSelectHaloPlex

 

SureSelect是一系列功能強大的exon capture試劑組,長達120 mers的探針,可以有效的結合上目標區域,增加專一性,而當實驗的檢體當中,目標區域有發生較大片段的insertion/deletion時,較長的探針也可以適度的改變結構來因應序列的改變,因此即便是目標序列有發生insertion/deletion的現象,探針也可以成功的結合,擷取下來。

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SureSelect的作用原理如下圖:

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Genomic DNA隨機碎裂後接上定序需要的adaptor

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將製備好的library與試劑組當中的hybridize bufferprobe混合在同一管中。

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這時已經設計好的probe會結合到目標序列上,由於probe上有標記biotin,因此之後加入帶有streptavidinbeads,便可以成功的與probe上的biotin進行結合。

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最後再以磁場固定住beads,將不是目標區域的DNA片段去除掉之後,便可以進行後面DNA放大、定序的步驟。

 

這樣子exome capture的方法,除了定序量相對全基因體定序來得少之外,因為沒有進行PCR的動作,所以不會像其他方法一樣,多了PCR artifacts的影響,也不需要用到特別的儀器才能進行。

 

在威健生技內部也進行過SureSelect和另一組較常見的exom capture試劑進行50X定序量的平行測試,比較在相同定序量之下,兩組試劑的純化效果。

 

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50X的定序量下,我們可以看到SureSelect試劑組的表現不管是在可以比對回exon上的readsbases百分比(% On-target reads% On-target bases)或是10X20X甚至是50X 覆蓋率的區域都遠較於另一組試劑表現來得好。

 

這樣的實驗結果也意味著,相較於另外一組exome capture試劑組,SureSelect純化擷取exome的特異性是比較好的,這樣在後面的定序實驗時也較不會浪費定序的base數在非目標區域的序列上,換句話說,在同樣的定序量下可以得到較多的有用資訊

 

在偵測SNPinsertion/deletion部分,目前也已經有相當多篇使用SureSelect來偵測疾病相關mutation的文獻被發表,例如Vissers等人在2010年發表的關於智力障礙與基因突變之間關係的研究;同年Hoischen等人發表的關於Schinzel-Giedion syndrome的研究等,都是利用SureSelect 找到與疾病相關的de novo mutations

 

除了常見的humanmouse all exon kit系列之外,也有針對DNA/RNA kinomeMethyl-Seq所推出的產品,搭配安捷倫所開發的免費工具SureDesign,甚至可以針對不同使用者的需求,來客製化不同位置的探針,而設計的方法也相當的平易近人、簡單快速。

 

參考資料

 

  1.       安捷倫科技 http://www.home.agilent.com/agilent/home.jspx?cc=TW&lc=cht#industries
  2.       Ng SB et al. "Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes". Nature 461 (7261): 272–276 (2009).
  3.       Lisenka E L M Vissers et al. “A de novo paradigm for mental retardation”. Nature Genetics 42, 1109–1112 (2010).
  4.       Alexander Hoischen et al.De novo mutations of SETBP1 cause Schinzel-Giedion syndrome”. Nature Genetics 42, 483–485 (2010).
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