MS-PCR  

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同文章請移至新網址 -> [試劑耗材] PCR 實驗心法 : MS-PCR (Methylation-specific PCR) - 專門用於檢測甲基化修飾的實驗技術

甲基化研究在表觀遺傳領域中是不可或缺的一門學問

有利用限制酶判斷甲基化與否的 MSAP 方法 (methylation-sensitive amplification polymorphism)

也有不需限制酶 使用 Primer 來進行 PCR 檢測的 MS-PCR (Methylation-Specific PCR) 技術

 

MS-PCR 是很常見廣泛應用於 CpG island 甲基化研究的技術 對實驗所需的成本也較低

此技術源自1996年由約翰霍普金斯醫學院的 Stephen Baylin 和 Jim Herman

基於 PCR 聚合酶連鎖反應原理所衍生發展出來

用以檢測 genomic DNA 樣品中的 CpG island 區域是否有甲基化修飾。

 

實驗原理如下 :

 

首先樣品 DNA 會先利用重亞硫酸鈉 (sodium bisulfite) 試劑進行作用

此過程會將沒有甲基化修飾的 cytosine (C) 轉變為 uracil (U) (這些 uracil 在後續的 PCR 實驗會經由增幅反應互補為 thymine (T))

接著需要設計可以和帶有甲基化修飾模板完全互補的 primer (模版序列C維持不變)

或者是設計和不帶有甲基化修飾模板完全互補的primer (即模版序列C會轉成U)

模板和所設計的 primer 能夠產生特異性結合 再藉由 PCR 產物結果來判斷甲基化修飾的存在與否

MS-PCR-02

 

此技術對於高度甲基化的 CpG island 能有較佳的測定能力

隨著 CpG island 區域甲基化比例程度越高 就能獲得越佳的偵測敏感性

雖然 MS-PCR 擁有敏感性高的特性 同時也不需使用到限制酶

但是對於 primer 的設計就顯得格外重要 除了需要預先知道待測 DNA 的序列以外

如果 DNA 的甲基化分布極不均勻 也會影響其檢測的效能

所以一般大多只能用於定性研究 而無法將之準確的量化。

 

除此之外 重亞硫酸鈉 (sodium bisulfite) 處理不完全或是 DNA 降解損壞也是影響實驗的關鍵

所以除了 primer 的設計要注意以外 挑選品質佳的重亞硫酸鈉試劑也是不可輕忽的重點。

 

Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB (1996). "Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands". Proc Natl Acad Sci USA 93 (13): 9821–9826.doi:10.1073/pnas.93.18.9821

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