Frederick Sanger

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同文章請移至新網址 -> [NGS] 次世代定序基本概念 (Basic Concepts of NGS)

只要談論到定序 (Sequencing),大家第一時間一定會想到 Frederick Sanger 這位有名的英國科學家!全世界到目前為止個人獲過兩次諾貝爾獎的僅有四人,Frederick Sanger 正是其中之一,而同時榮獲兩次諾貝爾化學獎這份殊榮更只有他一人。Sanger 於 1975 年發展出 Dideoxy Termination Method 也就是廣為人知 Sanger 定序法,這不僅只是他個人獲得諾貝爾獎的成就,對於人類基因體解碼計畫更是扮演著關鍵性的角色及地位。

進行 Sanger 定序必須要先將欲分析的目標分別一段一段的放大出來,若目標區域較長或較多就必須進行多次的放大,定序完後再進行比對或組裝,整個實驗步驟勢必繁瑣而費時;倘若有一種技術可不需額外先行放大目標,直接將整個區域進行定序後再分析,透過比對或組裝就可以找出研究者感興趣的區域或完整的序列資訊,相對來說絕對更有效率而快速,per base 的定序成本也大為降低,而次世代定序 (Next Generation Sequencing, NGS) 正好就是這技術的最佳代言人,而目前市面上應用比較廣泛的還是屬於二代定序,常見的有 Illumina (Solexa)、Roche (454)、ABI (SOLiD)。

相對於 Sanger 是目標區域放大後進行較長讀長定序 (約1000bp),NGS 是將核酸全面片段化後進行短讀長的定序,讀長依各家平台技術差異而略為不同,但整個概念就是以同時進行高通量的定序,因此也常聽到其他別名如 High-throughput Sequencing (HTS or HT-Seq)、Massively Parallel Sequencing (MPS)、Deep Sequencing、Next-gen Sequencing 等,這些名稱也無疑透露出 NGS 的特色。

NGS 主要實驗流程包含核酸片段化 (Fragmentation)、建庫 (Library Construction)、高通量定序 (High-throughput Sequencing)、分析 (Analysis) 共四個步驟。定序的方式分成單端定序 (Single Read or Single End)、雙端定序 (Paired-End & Mate Pair)。實驗步驟的流程隨著各平台與應用項目而略有差異及不同,Single End 及 Paired-End 的選擇也依實驗目的而有彈性的選擇,至於該如何選擇將在之後的文章更進一步的說明。

總結來說,NGS 的基本概念就是將核酸片段化後同時進行大規模的定序分析,實驗目的不外乎為了找已知或未知的序列資訊,找已知的前提就是該實驗樣品之物種必須有參考序列 (Reference Sequence),根據其相似度進行比對(Mapping) 及記數 (Counting) 的分析,若今天該物種無參考序列,就必須透過組裝 (Assembling) 的方式,進一步預測與驗證就可以獲得序列資訊。因此,熟記 NGS 的基本實驗流程、定序方式及其概念後,對 NGS 在各種項目的應用將更容易了解與切入!



ngs concept

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  • Alissa Chang
  • Cool~~~
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  • 訪客
  • thanks! 感謝簡單清楚的短文
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