點突變 mutagenesis primer 設計

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同文章請移至新網址 -> [試劑耗材] 點突變primer設計 人人都可上手 - QuikChange Primer Design 使用教學

說到 點突變實驗 (SDM, Site-Directed Mutagenesis)

對一些實驗室來說 每天點突變就像是家常便飯

和一般的PCR比起來 在primer的設計和反應參數等都大不相同

這對於剛接觸的人來說 有時還真是摸不著頭緒

 (對於點突變的原理和應用 之後會再特別介紹)

 

到底點突變要怎麼做才能成功 ?

primer要如何設計才好呢 ?

 

別擔心

看了以下的介紹 不到3分鐘 您也可以是 點突變達人!

 

這邊介紹一個 Agilent (Stratagene)的網頁 "QuikChange Primer Design"

SDM-20120425-15-18-44  

 

 

您可以進入 Agilent 網站來使用QuikChange Primer Design

Agilent Technologies|Genomics 安捷倫生命科學

http://www.genomics.agilent.com/

 

首先 在使用QuikChange Primer Design之前 需要有Agilent 的帳號 (免費註冊)

SDM-20120425-14-25-29  

 

第一步先登入或者註冊新帳戶

SDM-20120425-14-26-26  

 

第二步點選首頁上方連結列

Resoureces --> Tools

SDM-20120425-14-29-26  

 

點選Tools頁面右上方的QuikChange Primer Design
即可進入QuikChange Primer Design使用介面

SDM-20120425-14-29-45  

 

 

QuikChange Primer Design 簡單介紹

介面:

 SDM-20120425-14-30-11  

特色:

1. 實驗最佳化 可以針對Stratagene不同的點突變試劑設計合適的primer
2. 簡單 方便 快速 只需輸入或上傳序列 點選想突變的核酸或胺基酸位置 即可完成primer的設計
3. 同樣也可用於設計deletion實驗的primer
4. 完全免費的線上軟體
5. 可以免除突變胺基酸對照 primer的長度和Tm計算等問題

 

使用教學:

1. 清除之前的紀錄

SDM-20120425-16-02-49  

使用Clear Input按鈕
在每次使用前先清除前一次的上傳序列紀錄 可以避免發生不必要的錯誤


2. 選取您使用的點突變試劑

此範例以QuikChange Lightning為例

SDM-20120425-14-30-42  


3. 輸入或上傳檔案(fasta)

上船的檔案格式為fasta檔 (請注意上傳的是DNA序列)

SDM-20120425-14-44-07   


4. 選擇序列讀取方式

已選擇的檔案會出現檔案名稱於"選擇檔案按鈕"旁
這邊提供兩種方式上傳序列
第一種為DNA原序列上傳 點選Upload now按鈕

SDM-20120425-14-44-18  

可由點選DNA序列來選擇突變點位置

SDM-20120425-14-57-36  

 

另一種會將上傳的DNA序列轉成所對應的胺基酸
(請注意這邊轉換皆以reading frame 1顯示)

SDM-20120425-14-58-18  

如果需要只想看特定區域也可以自行設定轉譯範圍

SDM-20120425-14-59-03  

轉成胺基酸序列對於蛋白點突變的實驗來說較為簡便
這邊將以此方法來做後續使用說明


5. 選擇突變方式及位置

單點或多點點突變

1) 先點選Select up to seven amino acids that you want to change
2) 從上傳轉譯的胺基酸選擇要改變的胺基酸位置
從site 1~7選擇要突變的胺基酸種類
(注意 最多可同時選擇七個點
從選取的位置由小到大來決定site 1~7
點選胺基酸位置和site的數量要相等)
3) 點選Design primers即可設計自動出最適合的primer序列

SDM-20120425-15-04-04  

primer設計結果
包含primer的sense和antisense 同時也提供序列長度 Tm值等資訊
以及primer-template duplexes的模擬圖供參考!

SDM-20120425-15-04-38  

ex. 最多可同時設計七個突變點

SDM-20120425-15-07-05  

ex. 如果是相近序列的突變 (或者連續突變位點)
能將primer設計成同一條方便實驗

SDM-20120425-15-11-44  

SDM-20120425-15-11-06  

Deletion突變設計

1) 點選Delete a region between two....will not be deleted)
2) 選擇要做deletion的區域 點選要deletion的前後兩個胺基酸
選擇的胺基酸不會被去除
例如此範例是選425K和429L 結果會設計出426Y到428M三個位置的deletion
3) 點選Design primers即可設計自動出最適合的primer序列

SDM-20120425-15-13-09  

SDM-20120425-15-12-44  

 

這種方法設計primer很簡單吧

而且QuikChange Primer Design在手機上也可以使用

mutagenesis QR code  

 

工欲善其事 必先利其器 

用好方法 人人都能是點突變達人!!

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  • 5mt960001
  • 請問有Plasmid大小的限制嘛?