威健生技 Welgene Biotech Co., Ltd.

說到 點突變實驗 (SDM, Site-Directed Mutagenesis)

對一些實驗室來說 每天點突變就像是家常便飯

和一般的PCR比起來 在primer的設計和反應參數等都大不相同

這對於剛接觸的人來說 有時還真是摸不著頭緒

 (對於點突變的原理和應用 之後會再特別介紹)

到底點突變要怎麼做才能成功 ?

primer要如何設計才好呢 ?

別擔心

看了以下的介紹 不到3分鐘 您也可以是 點突變達人!

這邊介紹一個 Agilent (Stratagene)的網頁 "QuikChange Primer Design"

您可以進入 Agilent 網站來使用QuikChange Primer Design

Agilent Technologies|Genomics 安捷倫生命科學

http://www.genomics.agilent.com/

首先 在使用QuikChange Primer Design之前 需要有Agilent 的帳號 (免費註冊)

第一步先登入或者註冊新帳戶

第二步點選首頁上方連結列

Resoureces --> Tools

點選Tools頁面右上方的QuikChange Primer Design
即可進入QuikChange Primer Design使用介面

QuikChange Primer Design 簡單介紹

介面:

特色:

1. 實驗最佳化 可以針對Stratagene不同的點突變試劑設計合適的primer
2. 簡單 方便 快速 只需輸入或上傳序列 點選想突變的核酸或胺基酸位置 即可完成primer的設計
3. 同樣也可用於設計deletion實驗的primer
4. 完全免費的線上軟體
5. 可以免除突變胺基酸對照 primer的長度和Tm計算等問題

使用教學:

1. 清除之前的紀錄

使用Clear Input按鈕
在每次使用前先清除前一次的上傳序列紀錄 可以避免發生不必要的錯誤

2. 選取您使用的點突變試劑

此範例以QuikChange Lightning為例

3. 輸入或上傳檔案(fasta)

上船的檔案格式為fasta檔 (請注意上傳的是DNA序列)

4. 選擇序列讀取方式

已選擇的檔案會出現檔案名稱於"選擇檔案按鈕"旁
這邊提供兩種方式上傳序列
第一種為DNA原序列上傳 點選Upload now按鈕

 

可由點選DNA序列來選擇突變點位置

另一種會將上傳的DNA序列轉成所對應的胺基酸
(請注意這邊轉換皆以reading frame 1顯示)

 

如果需要只想看特定區域也可以自行設定轉譯範圍

轉成胺基酸序列對於蛋白點突變的實驗來說較為簡便
這邊將以此方法來做後續使用說明

5. 選擇突變方式及位置

單點或多點點突變

1) 先點選Select up to seven amino acids that you want to change
2) 從上傳轉譯的胺基酸選擇要改變的胺基酸位置
從site 1~7選擇要突變的胺基酸種類
(注意 最多可同時選擇七個點
從選取的位置由小到大來決定site 1~7
點選胺基酸位置和site的數量要相等)
3) 點選Design primers即可設計自動出最適合的primer序列

primer設計結果
包含primer的sense和antisense 同時也提供序列長度 Tm值等資訊
以及primer-template duplexes的模擬圖供參考!

ex. 最多可同時設計七個突變點

 

ex. 如果是相近序列的突變 (或者連續突變位點)
能將primer設計成同一條方便實驗

Deletion突變設計

1) 點選Delete a region between two....will not be deleted)
2) 選擇要做deletion的區域 點選要deletion的前後兩個胺基酸
選擇的胺基酸不會被去除
例如此範例是選425K和429L 結果會設計出426Y到428M三個位置的deletion
3) 點選Design primers即可設計自動出最適合的primer序列

這種方法設計primer很簡單吧

而且QuikChange Primer Design在手機上也可以使用

工欲善其事 必先利其器 

用好方法 人人都能是點突變達人!!