你可能有聽過複製羊, 複製豬, 複製人, 甚至克隆人這些名詞, 其實都源自於clone這一詞, 在生物學來說, clone指細胞從親細胞(parent cell)複製出完全相同的細胞, 是一種無性的複製, 有著相同的基因。而這邊說的cloning, 其實是一種技術, 在分子生物學中, cloning是一種將DNA複製並殖入另一個細胞的技術, cloning也有人翻譯為轉殖或選殖。
cloning在分生實驗中是常見的技術, 用於蛋白及酵素功能分析 (ex. 將人類特定的酵素基因片段轉入E. coli中, 利用E. coli來表現大量的酵素, 以便於分析蛋白的特性或結構)或者基因調控 (ex. 將特定蛋白基因轉入動物細胞中, 利用報導基因reporter gene的偵測, 來研究此蛋白是否參與訊息傳導)等研究, 然而一般要將目標基因或片段cloning到特定的載體(vector)上, 通常會先用PCR的方法將目標片段放大, 以方便後續的cloning實驗, 所以也可以稱為PCR cloning。
以下介紹幾種基本並且常見的PCR cloning技術
Restriction Enzyme Cloning
特點: 較為經濟, vector可自行製作, cloning目標片段時能有方向性
缺點: 效率普通 要額外設計帶有酵素切位的primer 時間長
1. 將目標片段PCR放大 (primer帶有RE切位)
2. 將PCR產物和vector一同用限制酶處理
3. 利用T4 ligase將兩者黏合
TA Cloning
特點: 免設計額外的primer, 效率好, 不需限制酶
缺點: TA vector需額外購買cloning目標片段無方向性
1. 將目標片段PCR放大
2. 將PCR產物加上A-overhang
3. 將帶有A-overhamg PCR的產物和vector用T4 ligase黏合
TOPO Cloning
特點: ligation時間短, 效率最好, 免設計額外的primer, 不需限制酶, 減少目標片斷產生重複
缺點: TOPO vector需額外購買,價格較其他方式高, cloning目標片段無方向性
1. 將目標片段PCR放大
2. 將帶有PCR產物和帶有topo的vector用加在一起, topoisomerase I即會產生黏合作用
改良式TOPO Cloning - StrataClone (Stratagene)
特點: ligation時間短, 效率最好, 免設計額外的primer, 不需限制酶, 減少目標片斷產生重複, 可容許大片段
缺點: TOPO vector和competent cell需額外購買, 價格較其他方式高, cloning目標片段無方向性
1. 將目標片段PCR放大
2. 將帶有PCR產物和帶有topo的vector arm加在一起, topoisomerase I即會產生黏合作用
3. 將線性的黏合產物轉入Strataclone SoloPack competent cell, 即能由細胞的Cre recombinase酵素將之互換為圓形黏合產物
無論甚麼方式的cloning各有其優缺點, 針對不同的實驗需求, 選擇適合的實驗方式, 能順利完成cloning才是最重要的!
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